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大大都肽的合成是通过接纳Fmoc或Boc保唬唬唬�；； ；；ひ斓墓滔嚯暮铣衫词迪值�，，，， ，然而在使用Fmoc-OSu时，，，， ，由于二肽（或三肽）和β-丙氨酰胺杂质的形成，，，， ，在氨基酸中未受保唬唬唬�；； ；；さ腘引入Fmoc似乎具有挑战性。。。。。。在此先容一种基于肟的衍生物Fmoc-Amox合成Fmoc-Gly-OH的有用要领，，，， ，且没有任何副反应。。。。。。Fmoc-Amox价钱低廉，，，， ，并且Amox在反应后可以很容易地去除，，，， ，从而提供不含任何有害杂质或污染物（主要是二肽或Amox自己）的纯Fmoc-Gly-OH，，，， ，这一点可以从高效液相色谱和核磁共振获得论证。。。。。。
1963年，，，， ，Merrifield形貌了一种全新的化学合成看法，，，， ，市场上有一些药物的活性因素(API)是TIDES（寡核苷酸和肽治疗剂），，，， ，含有多达30-40个单体，，，， ，这些单体是使用Merrifield首次形貌的固相要领生产的。。。。。。虽然一最先固相肽合成（SPPS）要领在某种水平上受到了他欧洲同事的质疑，，，， ，但现在此要领已经普遍应用于合成研究及生产。。。。。。
从命名可以看出，，，， ，所有氨基酸至少有两个官能团：一个羧酸和一个氨基。。。。。。若是氨基酸C最后羧酸的活性被不溶性高分子基团掩饰、氨基被暂时保唬唬唬�；； ；；て鹄�，，，， ，再逐步一连的加入反应，，，， ，也包括脱除氨基的保唬唬唬�；； ；；せ�，，，， ，然后与下一个N被保唬唬唬�；； ；；さ陌被峋傩信剂�。。。。。然而，，，， ，在三官能团氨基酸的情形下，，，， ，侧链则被永世（或半永世）保唬唬唬�；； ；；せ潘；；；；；； ；；ぁ�。。。。。早些年，，，， ，Merrifield使用苄基 (Bn) 举行恒久保唬唬唬�；； ；；�，，，， ，使用叔丁氧基羰基 (Boc)作为暂时保唬唬唬�；； ；；せ�，，，， ，可是Boc和Bn都可以在酸性条件下剖析：三氟乙酸（TFA）脱Boc、强酸如HF或三氟甲磺酸（TFMSA）水解Bn。。。。。。在70年月，，，， ，同样提出过Boc保唬唬唬�；； ；；せ诺腃arpino，，，， ，通过提出芴基甲氧羰基(Fmoc)作为暂时保唬唬唬�；； ；；ぐ被幕�，，，， ，彻底改变了肽化学领域，，，， ，即可以使用碱脱除N保唬唬唬�；； ；；せ�，，，， ，因而与Boc基团正交。。。。。。别的，，，， ，欧洲的Sheppard和Atherton，，，， ，与美国的Chang和 Meienhofer同时开发了Fmoc/t-Bu要领，，，， ，反应用TFA溶液处置惩罚后释放出肽。。。。。。该要领的实验标记着肽合成的“平民化”，，，， ，由于Boc/Bn要领的使用需要训练有素的化学事情者和特殊装备，，，， ，而通过Fmoc/t-Bu要领，，，， ，其他生物学实验室也能够合成肽。。。。。。别的，，，， ，该要领已实现了生产公斤级肽。。。。。。
最初商业化的Fmoc-氨基酸是用Schotten-Baumann要领合成：氨基酸与Fmoc-Cl在碱性条件下反应（图1A）。。。。。。80年月早期，，，， ，Ashish小组和Bachem、Goodman指出了大大都商业化Fmoc-氨基酸中包括二肽和三肽，，，， ，这些杂质来自Fmoc-Cl的高反应性，，，， ，它也可以与要保唬唬唬�；； ；；さ陌被岬聂然从μ焐狒�，，，， ，酸酐又可以与另一个氨基酸分子的胺最后反应，，，， ，导致形成二肽。。。。。。唬唬唬�；； ；；迫缤�1B所示。。。。。。
图1 氨基酸的Fmoc保唬唬唬�；； ；；�
A. Fmoc保唬唬唬�；； ；；せ�
B. 在氨基酸保唬唬唬�；； ；；だ讨行纬墒鼙；；；；；； ；；ざ牡幕�
思量到纵然是很小比例的杂质也会导致收率和纯度下降，，，， ，因此双方配合得出了阻止使用 Fmoc-Cl的结论。。。。。。由于这些副反应与离去基团的质量有关，，，， ，Ashish小组建议使用Fmoc-N3，，，， ，同样Carpino 和Han在他们的论文中也有提到此看法。。。。。。Ashish小组提出了用Fmoc-Cl和叠氮化钠合成Fmoc-N3，，，， ，为了阻止Fmoc-N3制备和存储的危险性，，，， ，现做现用，，，， ，该要领合成的Fmoc-氨基酸具有较高纯度。。。。。。Verlander等人通过筛选差别的离去基团，，，， ，建议使用Fmoc-OSU，，，， ，与此同时，，，， ，Bolin等人建议使用甲硅烷基化试剂保唬唬唬�；； ；；然�。。。。。多年后，，，， ，Barlos等人提出了从Trt-Cl制备Trt-氨基酸的要领，，，， ，以阻止Trt酯类杂质的天生。。。。。。厥后，，，， ，Suresh等人提出在活化锌粉保存下用Fmoc-Cl制备Fmoc-氨基酸，，，， ，此要领允许在中性条件下举行。。。。。。
然而，，，， ，恒久以来最常用的Fmoc-氨基酸合成要领是Fmoc-OSu（或 NHS），，，， ，当Hlebowicz等人对Fmoc-Cl制备Fmoc-氨基酸提出质疑时，，，， ，该要领也受到了质疑。。。。。。Bachem Europe的研究批注，，，， ，使用Fmoc-OSu制备的Fmoc-AA-OH中含有Fmoc-β-Ala-OH和Fmoc-β-Ala-AA-OH，，，， ，这两个杂质是在OSu攻击一个羰基后通过Lossen重排形成的（图2）。。。。。。
图2 β-丙氨酰胺通过Lossen重排的形成机制
这些发明再次引发了开发新试剂或清静引入Fmoc基团要领的研究热情。。。。。。表1列出了用于保唬唬唬�；； ；；ぐ被岬牟畋餏moc衍生物及其用于制备Fmoc-Gly-OH的效果，，，， ，虽然这种反应可以用于所有氨基酸的保唬唬唬�；； ；；�，，，， ，但Gly更显着，，，， ，由于它的低位阻有利于高效率的聚合。。。。。。这些引入Fmoc的衍生物应具有两个要害特征：（i）无特殊高反应性，，，， ，阻止低聚肽的形成；；；；；； ；；（ii）离去基团通常是被氨基酸取代的羟基化合物，，，， ，在处置惩罚历程中相对更容易去除。。。。。。因此，，，， ，Ashish小组首先提出了 Fmoc-2-巯基苯并咪唑，，，， ，它合成的Fmoc衍生物中低聚肽较少（表1，，，， ，#4）。。。。。。然而，，，， ，反应中释放的副产品2-MBT消融度差，，，， ，需要用有机溶剂洗涤才华完全去除，，，， ，而Fmoc-氨基酸在有机溶剂中也有一定的消融度，，，， ，因此倒运于最终产率。。。。。。Verlander等人遇到了类似的问题，，，， ，当使用（多）氯苯基衍生物时，，，， ，有机溶剂醇污染了最终产品，，，， ，导致总收率低（4-30%）。。。。。。
其他琥珀酰亚胺的衍生物，，，， ，例如邻苯二甲酰亚胺、降龙脑烯基（它是由降龙脑烯衍生的自由基）和响应的螺环类似物、六元衍生物等，，，， ，也举行了剖析，，，， ，但并不具有显著优势（表1，，，， ，#5-7）。。。。。。同时，，，， ，当降龙脑烯基与EDC结适用于水中的固相肽合成 (SPPS) 时，，，， ，检测到了β-丙氨酸的形成。。。。。。为了战胜使用琥珀酰亚胺衍生物导致β-丙氨酰胺残基嵌入问题，，，， ，Najera等人提出了一种聚合物形式的试剂，，，， ，最终β-丙氨酰胺污染物是牢靠在聚合物载体上的，，，， ，但这种要领限制了制备少量保唬唬唬�；； ；；ぐ被岬氖褂谩�。。。。。
通常与碳二亚胺偶联化合物例如五氟苯基(Pfp)或苯并三唑(Bt)一起使用的其他活性物质，，，， ，虽然这些试剂价钱相对偏高(Pfp)或易爆(Bt)（表1、#8、9），，，， ，但产率很高，，，， ，有些实验室甚至研究了Fmoc-三嗪衍生物（表1，，，， ，#10）作为一种合成Fmoc-氨基酸的要领。。。。。。关于使用纯水溶液引入Fmoc的要领，，，， ，已使用Fmoc-苯基二甲基锍甲基硫酸盐 (Fmoc-ODsp)，，，， ，但未研究是否有二肽的形成（表1，，，， ，#11）。。。。。。
为了战胜肽结构单位合成中的最大挑战之一，，，， ，即在氨基酸保唬唬唬�；； ；；だ讨胁幌Ｍ纬啥暮腿�，，，， ，已经深入研究了大宗Fmoc离去基团的要领。。。。。。只管少量试剂有还不错的效果，，，， ，但基本没有一种有潜力能应用于工业化生产。。。。。。在此方面，，，， ，基于常用的碳二亚胺添加剂肟的结构，，，， ，提出了Fmoc离去基团衍生物Fmoc-Amox。。。。。。Fmoc-Amox已用于保唬唬唬�；； ；；ぜ妆⒏狈从Φ腍-Gly-OH，，，， ，有很高的收率 (93%) ，，，， ，并且完全没有Fmoc-二肽形式的副产品爆发，，，， ，这从 HPLC和NMR剖析中获得印证。。。。。。别的，，，， ，Amox衍生物未来或允许用于引入其他保唬唬唬�；； ；；せ�，，，， ，例如pNZ、Alloc和Boc。。。。。。
Ashish小组以为Oxyma是比碳二亚胺更优异的添加剂，，，， ，Oxyma反应性强，，，， ，在肽的工业化生产中的应用越来越普遍。。。。。。小组也研究了其他反应性较低的肟衍生物来引入Fmoc基团，，，， ，从第一次筛选�。。。。。ū�1，，，， ，#12-16）中，，，， ，包括2-羟基吡啶N-氧化物(HOPO)，，，， ，Oxyma衍生物（表1，，，， ，#12）由于其高反应性而获得含量较多的二肽，，，， ，然后是HOPO（表1，，，， ，#16）。。。。。。氰基吡啶肟也是较好的添加剂（表1，，，， ，#15），，，， ，但其价钱腾贵，，，， ，并且很难从反应中去除。。。。。。第二次筛选获得的二肽形成量总体较少（表1，，，， ，#17-20），，，， ，因此选择氰基酰胺衍生物（Amox）（表1，，，， ，#20）作为替换 HOSu 以引入Fmoc。。。。。。Fmoc-Amox价钱相宜，，，， ，并且在反应后可以很容易地去除，，，， ，这与MBT的情形差别，，，， ，Amox 在水中的消融度为0.9 M，，，， ，这确保了它不会污染最终的Fmoc-氨基酸（表1，，，， ，#4）。。。。。。
在Fmoc-二肽形成方面，，，， ，H-Gly-OH被证实是评估Fmoc-Amox性能的最佳试剂，，，， ，由于其低空间位阻有利于高比例的寡聚化。。。。。。使用1克和40克两种平行实验制备Fmoc-Gly-OH效果靠近，，，， ，反应历程形貌如下：将Fmoc-Amox的丙酮溶液缓慢加入到搅拌的H-Gly-OH和碳酸钠水溶液中，，，， ，通过一连分批添加碳酸钠将反应混淆物的pH值坚持在9-10。。。。。。通过TLC以及pH稳固性监测反应(pH的降低作为爆发反应的标记)。。。。。。反应完成后(4小时)，，，， ，除去溶剂，，，， ，剩余的水层用DCM洗涤，，，， ，然后加入1N HCl(直到pH＜2)，，，， ，获得灰白色沉淀，，，， ，然后过滤沉淀物并使用乙酸乙酯和正己烷(93％)重结晶，，，， ，HPLC检测Fmoc-Gly-OH的纯度很是好。。。。。。由于通过固相手艺制备的Fmoc-Gly-Gly-OH会与Fmoc-Gly-OH一起被洗脱出来，，，， ，批注形成的二肽杂质是难去除的，，，， ，如图 3所示，，，， ，色谱图中没有视察到二肽的痕迹（图3）。。。。。。别的，，，， ，1H NMR 未显示Amox保存任何污染（图4），，，， ，这清晰地批注Amox在合成Fmoc氨基酸方面有很大的优势。。。。。。
图3 (A) Fmoc-Gly-OH和一同洗脱的Fmoc-Gly-Gly-OH的HPLC色谱图
(B) Fmoc-Gly-OH的HPLC色谱图
图4 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR较量
在这些效果的推动下，，，， ，使用上述要领制备了Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Val-OH（各10 g小试）（图5和6）。。。。。。最终产品的纯度通过HPLC和NMR确认，，，， ，没有显示二肽的微量形成。。。。。。唬唬唬�；； ；；寡芯苛巳芗猎诤蟠χ贸头＠讨械闹饕�，，，， ，将所得产品消融在DCM中并使用蒸馏水萃取，，，， ，DCM后处置惩罚有助于去除微量的Amox，，，， ，从而爆发经NMR证实的纯品（图 7）。。。。。。
图5 (I)A. Fmoc-Phe-OH与Fmoc-Phe-Phe-OH一同洗脱的HPLC色谱图
B. Fmoc-Phe-OH的 HPLC色谱图
(II) Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR较量
图6 (I) A. Fmoc-Val-OH与Fmoc-Val-Val-OH一同洗脱的HPLC色谱图
B. Fmoc-Val-OH的 HPLC色谱图
(II) Fmoc-Val-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR较量
图7 使用乙酸乙酯和DCM萃取Fmoc-Phe-OH的后处置惩罚较量
这些效果清晰地批注晰Fmoc-Amox在合成最容易爆发副反应的Fmoc-氨基酸方面具有很大的优越性。。。。。。
Fmoc-氨基酸的合成实例：
1、将甘氨酸（131.34mmol）、碳酸钠（106mmol）加到纯化水中，，，， ，滴加Fmoc-Amox（119.4mmol）的丙酮溶液，，，， ，包管反应液pH始终坚持在9-10。。。。。。待TLC检测Fmoc-Amox反应完全，，，， ，将反应液浓缩去除丙酮后用二氯甲烷萃取除杂，，，， ，水相用1N HCl调酸，，，， ，大宗白色固体析出，，，， ，过滤，，，， ，滤饼用纯化水洗三遍。。。。。。网络固体用乙酸乙酯/正己烷重结晶，，，， ，获得高纯度的Fmoc-甘氨酸。。。。。。
2、将苯丙氨酸或缬氨酸（33mmol）、碳酸钠（75mmol）加到纯化水中，，，， ，滴加Fmoc-Amox（30mmol）的丙酮溶液，，，， ，包管反应液pH始终坚持在9-10。。。。。。待TLC检测Fmoc-Amox反应完全，，，， ，将反应液浓缩去除丙酮后用二氯甲烷萃取除杂，，，， ，水相用1N HCl调酸，，，， ，大宗白色固体析出，，，， ，过滤，，，， ，滤饼用纯化水洗三遍。。。。。。网络固体用乙酸乙酯/正己烷重结晶，，，， ，获得高纯度的Fmoc-苯丙氨酸或Fmoc-缬氨酸。。。。。。
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